microRNA Isolation Kit——分離miRNA或靶mRNA
microRNA(miRNA)雖然只有22個(gè)左右的堿基，但是在基因表達(dá)調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，參與細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育，且與多種疾病相關(guān)。因此對(duì)于miRNA的研究越來(lái)越多。傳統(tǒng)的miRNA分離方法是結(jié)合了基于酚/胍的樣品裂解和硅膠膜離心柱，直接將總RNA分離出來(lái)，不能直接分離出miRNA。
Wako的miRNA純化試劑盒能夠制備高純度的miRNA片段，在細(xì)胞中，成熟的miRNA分子可與Argonaute(Ago)蛋白家族形成RNA沉默復(fù)合體(RISC)，此純化試劑盒利用免疫沉淀方法，與Ago蛋白結(jié)合抗體的特異性，分離miRNA。純化的miRNA片段含有非常少的rRNA和tRNA降解片段。與傳統(tǒng)的miRNA純化方法相比，有效提高了miRNA的克隆效率。純化的miRNA可用于分析miRNA的靶mRNA。
n 特點(diǎn)
1) 內(nèi)源性Ago蛋白的免疫沉淀
2) 高度純化與Ago蛋白結(jié)合的miRNA
3) 其他RNAs的污染少，比如rRNA & tRNA
4) 純化的microRNA片段可用于高效的microRNA克隆和微陣列
5) 可同時(shí)分離miRNA和靶mRNA，便于直接進(jìn)行后續(xù)的靶mRNA的克隆和定量分析
與常規(guī)方法比較
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常規(guī)方法 |
Wako的新方法 |
| 總RNA提取 |
需要 |
不需要 |
| 小RNA (≦200nt)的純化 |
| 變性PAGE電泳 |
| 從變性PAGE凝膠中進(jìn)行凝膠抽提 |
| 從變性PAGE膠中進(jìn)行凝膠純化 |
| rRNA片段污染率 |
高 |
低 |
| tRNA片段污染率 |
高 |
低 |
| 操作時(shí)間 |
≦12小時(shí) |
≦4小時(shí)
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使用例1：
圖1：使用microRNA Isolation Kit,Human Ago2純化microRNA片段
從培養(yǎng)的人類(lèi)細(xì)胞系（HeLa,HepG2,HEK293）中純化的microRNA片段用Urea-PAGE和銀染方法（Wako Cat. No. 311-03961；CLEAR STAIN Ag）檢測(cè)。每個(gè)細(xì)胞系的數(shù)目大約是5×106。上樣量是用該試劑盒純化后獲得的5ul microRNA溶液（制備的溶液一般是10ul）。
siRNA藥理研究
將小分子干擾RNA（siRNA）直接注入細(xì)胞中，這些siRNA結(jié)合蛋白元件，也可形成RISC，此試劑盒也可純化與Ago2結(jié)合的siRNA，便于后續(xù)的siRNA研究分析。因此此試劑盒不僅能分離miRNA，亦可作用于siRNA，大大拓寬了試劑盒的使用范圍。
后續(xù)研究：
1）RNAi的抑制效果
2）siRNA的藥代過(guò)程
3）體內(nèi)siRNA的穩(wěn)定性
4）毒性/副作用
5）對(duì)于非特異性mRNAs的脫靶效應(yīng)
貨號(hào) 品名 規(guī)格
291-70201microRNA Isolation Kit, Human/Mouse Ago1 10tests
292-66701 microRNA Isolation Kit, Human Ago2 10tests
292-67301 microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 10tests
297-70301 microRNA Isolation Kit, Human Ago3 10tests
290-66501 microRNA Cloning Kit 8tests
298-65103 Single Strand DNA Ligase, Thermostable, recombinant, Solution 200units
292-65101 Single Strand DNA Ligase, Thermostable, recombinant, Solution 500units
298-67901 PCR Purification Kit 30tests
298-68001 Target mRNA Cloning Kit 10tests
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